IMMUNOAFFINITY PURIFICATION
IgG: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 trong đó các chuỗi nặng lần lượt là gamma 1, gamma 2,
gamma 3, gamma 4.
IgA: IgA1, IgA2 tùy theo chuỗi nặng là alpha 1 và alpha 2.
- Đặc điểm về cấu trúc của các lớp:
● IgG ở dạng monome đơn phân tử, trọng lượng là 150000 (chuỗi nhẹ kappa hoặc lamda
là 25000, chuỗi nặng gamma là 50000).
● IgA có 2 dạng: dạng monome đơn phân tử, trọng lượng là 160000, dạng dime nhị phân
thường có trong dịch tiết gọi là IgA tiết (slgA, secretoire: tiết).
● Igm thường ở dạng ngũ phân trọng lượng là 900000.
● IgD ở dạng đơn phân tử trọng lượng 175000.
● IgE ở dạng đơn phân tử trọng lượng là 190000.
Các immunoglobulin khác nhau về chuỗi nặng: về tỉ lệ % gluxit và đặc biệt là khác
nhau ở đoạn Fc liên quan đến chức năng của từng immunoglobulin.
Bảng 2: Tính chất
của các lớp kháng
thể
5
IMMUNOAFFINITY PURIFICATION
1.3. Đặc điểm, chức năng của kháng thể (1)
1.3.1. Đặc điểm của kháng thể
1.3.1.1. Tính kháng thể
Tính kháng thể là khả năng kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên tương ứng, đặc
hiệu có nghĩa là kháng thể do kháng nguyên nào kích thích tạo ra thì chỉ kết hợp với
kháng nguyên ấy mà thôi. Tính kháng thể là đặc điểm quan trọng nhất của kháng thể.Tuy
nhiên đôi khi xảy ra phản ứng chéo giữa kháng thể và kháng nguyên không tương ứng do
kháng nguyên này có cấu trúc gần giống với kháng nguyên đã kích thích tạo ra nó. Phản
ứng chéo cho hình ảnh dương tính giả trong phản ứng miễn dịch.
Vị trí gắn với kháng nguyên nằm ở đoạn Fab, giữa các CDR của mỗi cặp chuỗi
nặng và chuỗi nhẹ. Như vậy mỗi phân tử kháng thể nguyên vẹn có hai vị trí gắn với
kháng nguyên, gọi là có hóa trị hai. Kháng thể dạng dime có hóa trị 4, kháng thể dạng
pentame có hóa trị 10. Nhờ kháng thể có hóa trị hai trở lên mà kết hợp kháng nguyên-
kháng thể có thể tạo ra được mạng lưới Marrack.
Đoạn F(a’b’)
2
cũng có hóa trị hai nên có thể được sử dụng thay thế phân tử kháng
thể nguyên vẹn trong một số phản ứng miễn dịch khi cần tránh những tác dụng riêng của
đoạn Fc.
1.3.1.2. Tính kháng nguyên
- Tính kháng nguyên của phân tử kháng thể là khả năng kích thích cơ thể khác tạo ra
kháng thể kháng lại chính nó. Lý do là phân tử kháng thể bản chất là một loại protit có
trọng lượng phân tử đủ lớn, đủ tiêu chuẩn là một kháng nguyên đối với cơ thể khác.
Kháng thể kháng lại kháng thể được gọi là anti-lg.
- Phân biệt 3 nhóm kháng nguyên trên phân tử kháng thể:
+ Nhóm kháng nguyên isotyp: Các quyết định kháng nguyên isotyp giống nhau ở
mọi cá thể trong cùng một loài và nằm trên vùng hằng định của chuỗi nặng và chuỗi
nhẹ.Các lớp dưới kháng thể IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM, IgD và IgE có
các quyết định kháng nguyên isotyp khác nhau.
+ Nhóm kháng nguyên allotyp: Các quyết định kháng nguyên allotyp giống nhau
ở một số cá thể trong cùng một loài và nằm rải rác trên vùng hằng định của chuỗi nặng và
chuỗi nhẹ.
6
IMMUNOAFFINITY PURIFICATION
+ Nhóm kháng nguyên idiotyp: Các quyết định kháng nguyên idiotyp đặc trưng
cho từng cá thể và nằm trên vùng thay đổi của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ. Mỗi quyết đinh
kháng idiotyp được gọi là idiotop, tập các idiotop gọi là idiotyp.
1.3.2. Chức năng của kháng thể
1.3.2.1. Chức năng do vùng hằng định Fc đảm nhiệm
- Cố định bổ thể: Phân tử kháng thể thuộc các lớp và dưới lớp IgM, IgG1, IgG2,
IgG3 sau khi kết hợp với kháng nguyên thì sự tương tác giữa các đoạn Fc của chúng làm
bộc lộ vị trí cố định bổ thể trên CH2, nhờ đó thành phần C1q của bổ thể đến bám vào,
dẫn đến hoạt hóa bổ thể theo con đường cổ điển (xem phần Bổ thể).
- Truyền qua rau thai: Do đặc điểm cấu tạo của đoạn Fc của phân tử kháng thể
thuộc lớp IgG, nhất là dưới lớp IgG1, IgG3, IgG4, kháng thể có thể được truyền từ mẹ
qua thai nhi, tạo đáp ứng miễn dịch thụ động cho trẻ sơ sinh trong khoảng sáu tháng đầu
tiên.
- Gắn trên bề mặt tế bào: Các phân tử kháng thể thuộc các lớp và dưới lớp IgE,
IgG1, IgG3, IgG4 có khả năng gắn trên bề mặt các tế bào mast và bạch cầu ái kiềm thông
qua các receptor đối với đoạn Fc của chúng (FcR). Do vậy khi có kháng nguyên đến
kết hợp với kháng thể trên bề mặt các tế bào này thì sẽ dẫn tới hai quá trình: (1) quá trình
giải phóng các chất sinh học có sẵn trong các hạt của tế bào như histamin, serotonin; (2)
quá trình tổng hợp từ phospholipit màng tế bào tạo ra các chất như là PAF,
leucotrien, prostaglandin, thromboxan gây quá mẫn nhanh (xem chương Rối loạn miễn
dịch).
- Gây hiện tượng opsonin hóa (opsonisation): Các đại thực bào và bạch cầu đa
nhân trung tính có receptor đối với đoạn Fc của các kháng thể thuộc lớp IgG và IgM.
Khi các kháng thể này kết hợp với các kháng nguyên vi khuẩn, thì các đoạn Fc của
chúng thu hút các FcR của đại thực bào và bạch cầu đa nhân trung tính, làm cho những tế
bào thực bào này dễ tiếp cận vi khuẩn hơn.
Cũng theo cơ chế trên, các tế bào NK (natural killer: tế bào giết tự nhiên) nhờ có
FcR đối với đoạn Fc của lớp kháng thể IgG nên dễ tiếp cận và tiêu diệt tế bào đích hơn.
Hiện tượng này gọi là hiệu ứng ADCC (antibody dependent cellular cytotoxicity: độc tế
bào phụ thuộc kháng thể).
1.3.2.2. Chức năng do vùng thay đổi V đảm nhiệm
- Nhận diện kháng nguyên: Chức năng này đã được trình bày trong phần tính
kháng thể. Thông qua phản ứng kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên tương ứng mà kháng
nguyên (1) trung hòa kháng nguyên hòa tan như độ tố vi khuẩn; (2) ngưng kết thành các
thành phần hữu hình như vi khuẩn; (3) ngăn cản vi khuẩn bám vào màng nhầy niêm mạc
đường hô hấp và tiêu hóa (tác dụng của slgA).
- Truyền tín hiệu: Sự nhận diện kháng nguyên tạo tín hiệu cho lympho B tái phân
bố các kháng thể bề mặt mở đầu cho quá trình trình diện kháng nguyên của lympho B.
7
Hình 3: Vị trí các điểm chức năng trên phân tử IgG
IMMUNOAFFINITY PURIFICATION
Mỗi chuỗi nhẹ có 2 gấp khúc và mỗi chuỗi nặng có 4 gấp khúc. Mỗi gấp khúc có
khoảng 60 axit amin. Edelman (1970) cho rằng chức năng vùng gấp khúc VH và VL là
hợp tác với nhau để tạo nên bề mặt của vị trí kết hợp với kháng nguyên. Các vùng gấp
khác làm nhiệm vụ trung gian cho các chức năng của kháng thể (gắn với bổ thể, gắn với
thụ thể của các tế bào thực bào). (3)
1.4. Kháng thể đơn dòng (2)
Trong tự nhiên, kháng nguyên có nhiều nhóm quyết định (kháng nguyên đa giá),
do đó sẽ kích thích cơ thể tạo thành không phải một mà là một phức hợp kháng thể.
Muốn nhận một loại kháng thể trong phức hợp ấy thì phải tiến hành tách tinh khiết. Năm
1975 Milstein và Kohler đã tiến hành lai bằng con đường dung hợp tế bào ung thư tuỷ và
tế bào lympho B. Tế bào ung thư có khả năng phân chia nhanh nhưng không tạo thành
kháng thể, ngược lại tế bào B có khả năng hình thành kháng thể nhưng không có khả
năng phân chia vì chúng là tế bào tận cùng của quá trình biệt hoá.
Tế bào lai có được ưu điểm của cá hai tế bào trên: vừa phân chia rất nhanh vừa có
khả năng tổng hợp kháng thể.
Tiến hành pha loãng liên tục trong giếng của phiến nhựa vi lượng cho đến khi mỗi
giếng chỉ có một tế bào. Từ một tế bào đơn chỉ sản xuất một dòng kháng thể thuần khiết.
Do vậy kháng thể đơn dòng là kháng thể do một dòng tế bào B sinh ra để chống lại một
quyết định kháng nguyên.
Kỹ thuật kháng thể đơn dòng đã được áp dụng rộng rãi để thay thế dần một số
phương pháp huyết thanh thông thường như xác định hocmon trong đánh giá chức năng
nội tiết, xác định protein chấn đoán ung thư, xác định nồng độ thuốc trong máu với độ
nhạy cao gấp nhiều lần so với các biện pháp thông thường. Có thể đưa thuốc đến tận mục
tiêu cần tiêu diệt như là tên lửa đạo đạn. Thuốc sẽ được phóng thích liên tục để diệt các tế
bào ung thư. Kỹ thuật đơn dòng cũng được dùng để xác địng doping trong thể thao.
2. Kháng nguyên
2.1. Định nghĩa (3)
Kháng nguyên (antigen) là tất cả các chất, đôi khi kể cả thành phần cấu tạo của cơ
thể, khi xâm nhập vào cơ thể sinh vật sẽ gây nên một đáp ứng miễn dịch, tức một quá
trình sinh học phức tạp dẫn đến sự tổng hợp những phân tử đặc biệt gọi là kháng thể
8
IMMUNOAFFINITY PURIFICATION
(dịch thể hay kháng thể tế bào) và chúng có đặc tính liên kết đặc hiệu với kháng nguyên
đó. Tóm lại, kháng nguyên là chất gây ra đáp ứng miễn dịch đặc hiệu và phản ứng với
các sản phẩm của đáp ứng đó.
Bằng chứng độc nhất nói lên một chất đúng là một kháng nguyên khi chứng minh
được có đáp ứng miễn dịch chống lại nó.
9
IMMUNOAFFINITY PURIFICATION
2.2. Các đặc tính của kháng nguyên (1)
2.2.1.Tính sinh miễn dịch của kháng nguyên
Tính sinh miễn dịch của một kháng nguyên phụ thuộc vào các yếu tố sau :
2.2.1.1. Tính “lạ” của kháng nguyên
Một kháng nguyên có tính sinh miễn dịch càng cao khi sự khác biệt giữa cơ thể
nhận va kháng nguyên càng nhiều hay nói cách khác kháng nguyên càng “lạ” với cơ thê
nhận bao nhiêu thi khả năng kích thích tạo kháng thể càng mạnh bấy nhiêu.
Ví dụ: Albumin của gà hay chim có tính sinh miễn dịch cao hơn albumin bò khi cùng đưa
vào cơ thể loài dê.
Tuy nhiên cần lưu ý rằng các kháng nguyên protein của cơ thê này cũng có thể
kích thích một cơ thê khác cùng loài sản xuất kháng thể nếu kháng nguyên protein đủ lạ
đối với protein của cơ thể nhận. Hơn nữa trong một số trường hợp bệnh lý thì thành phần
của chính cơ thê cũng có thể gây ra đáp ứng tạo kháng thể chống lại nó, ngươi ta gọi
những thành phần này là “tự kháng nguyên”.
2.2.1.2. Cấu tạo hóa học của kháng nguyên
Các kháng nguyên thuộc loại protein và polysaccarid có tính sinh miễn dịch cao
khi dùng dưới dạng hòa tan và cả khi chúng nằm trong một cấu trúc phức hợp, ví dụ vỏ vi
khuẩn.
Các kháng nguyên là lipid, steroid và axit nucleic có tính sinh miễn dịch yếu
hoặc không có tính sinh miễn dịch.
Kháng nguyên càng phức tạp về cả cấu tạo lẫn kích thước thì chúng càng có thể
kích thích một đáp ứng miễn dịch mạnh. Ví dụ: các kháng nguyên hữu hình (vi khuẩn,
virus ,các tế bào). Các phân tử protein lớn (hemoxyamin) cũng có tính kháng nguyên
mạnh.
Trên cấu trúc của kháng nguyên có những vị trí chịu trách nhiệm chính trong việc
kích thích tạo kháng thể và kết hợp với kháng thể khi xảy ra phản ứng kết hợp kháng
nguyên - kháng thể. Những vị trí này được gọi là những quyết định kháng nguyên
(determinant antigen) hay epitop. Kháng nguyên càng phức tạp càng có nhiều epitop, do
đó tính sinh miễn dịch càng cao.
Ngòai thành phần hóa học ra, cấu trúc lập thể và khả năng tích điện của các phân
tử kháng nguyên cũng có ảnh hưởng đến tính sinh miễn dịch. Có lẽ sự tích điện có vai trò
trong việc chọn lọc các tế bào lympho có thụ thể đặc hiệu tương ứng. Còn cấu trúc lập
thể có ảnh hưởng đến mức độ chuyên hóa của kháng nguyên trong cơ thể nhân (khi bị
chuyên hóa các kháng nguyên sẽ để lộ thêm các quyết định kháng nguyên).
2.2.1.3. Cách gây miễn dịch và liều kháng nguyên
Hầu hết các kháng nguyên hữu hình (vi khuẩn, hồng cầu, viris hoặc các polymer
lớn) khi đưa vao cơ thể nhận bằng đường tĩnh mạch hoặc tiêm bắp với liều khác nhau đều
có thể dễ dàng kích thích tạo kháng thể. Trong khi đó, nhiều kháng nguyên là protein
hòa tan phải có một quy trinh gây miễn dịch thích hợp hoặc phải cần một chất hỗ trợ mới
10
IMMUNOAFFINITY PURIFICATION
gây được đáp ứng tốt. Chất hỗ trợ đó được gọi là tá chất, loại thường được dùng là tá chất
Freund gồm hỗn dịch vi khuẩn lao chết trộn trong nước và dầu.
Một số nghiên cứu cho thấy tá chất có tác dụng làm tăng chức năng của đại thực
bào và tế bào lympho T hỗ trợ.
2.2.1.4. Khả năng đáp ứng của cơ thê
Đây là một yếu tố quan trọng : cùng một kháng nguyên nhưng các cơ thể khác
nhau có những đáp ứng ở nhiều mức độ khác nhau. Vì thế Landsteiner đã phân biệt hai
khái niệm: tính kháng nguyên và tính sinh miễn dịch, trong đó:
Tính sinh miễn dịch = Tính kháng nguyên + Khả năng đáp ứng của cơ thể nhận
2.3. Tính đặc hiệu của kháng nguyên
Tính đặc hiệu của một đáp ứng miễn dịch là do:
- Mỗi kháng nguyên có một cấu trúc đặc hiệu riêng.
- Khả năng nhận biết một cách đặc hiệu của các tế bào lympho do có thụ thể cho từng
loại kháng nguyên.
Tính đặc hiệu của kháng nguyên không phải do toàn bộ cấu trúc của cả phân tử kháng
nguyên quyết định mà do những quyết định kháng nguyên (epitop ) quyết định.
Epitop có hai chức năng:
- Kích thích cơ thể tạo ra đáp ứng miễn dịch đặc hiệu với kháng nguyên đó.
- Làm vị trí để kháng thể hoặc tế bào lympho T mẫn cảm có thể gắn vào một cách đặc
hiệu.
Một kháng nguyên protein phức tạp có thể có nhiều quyết định kháng nguyên
khác nhau do đó mà nó có thể kích thích tạo ra nhiều loại kháng thể khác nhau cùng một
lúc. Tùy theo kháng nguyên có thể phản ứng cùng lúc với một hoặc nhiều kháng huyết
thanh chứa kháng thể do nó tạo ra mà người ta gọi là kháng nguyên đơn giá hay kháng
nguyên đa gía . (Trong các phản ứng huyết thanh học chỉ có các kháng nguyên đa giá mới
có khả năng tạo ra mạng lưới kết tủa hoặc ngưng kết với các kháng thể tương ứng ).
Phản ứng chéo (Cross - reaction): Tính đặc hiệu của kháng nguyên rất cao tuy vậy
trong thực tế hai kháng nguyên khác nhau có thể có phản ứng chéo với nhau. Nguyên
nhân của phản ứng chéo là do trên hai kháng nguyên này có hai epitop giống nhau hoặc ít
nhất là tương tự nhau.
Phản ứng chéo dễ xảy ra với các kháng nguyên polysaccharid và cũng xảy ra với
các kháng nguyên protein (vi dụ: albumin trứng gà và albumin trứng vịt ).
Trong thừc nghiệm chúng ta có thể loại trừ phản ứng chéo bằng phương pháp hấp
thụ. Ví dụ: ta biết kháng huyết thanh kháng A thường cho phản ứng chéo với kháng
nguyên B nên khi làm phản ứng tìm kháng nguyên A thì kết quả dễ sai lạc do tìm nhầm
cả B. Như vậy trước khi tìm A ta cho ủ kháng huyết thanh kháng A với kháng nguyên B,
những phân tử nào cho phản ứng chéo sẽ tạo phức hợp vơi B. Sau đó loại bỏ phức hợp
này bằng ly tâm ta sẽ có kháng huyết thanh kháng A tinh khiết không còn phản ứng chéo
vơi B.
II. Tinh sạch ái lực miễn dịch
11
IMMUNOAFFINITY PURIFICATION
1. Mục đích (4)
Nghiên cứu tương tác protein có ý nghĩa quan trọng nhằm xác định chức năng và
sự tham gia của chúng vào một hay nhiều hoạt động sống cụ thể như quá trình phân chia
tế bào, sao chép DNA, tổng hợp protein hay vận chuyển tín hiệu. Trên thực tế có nhiều
phương pháp khác nhau dùng cho nghiên cứu tương tác protein như; sắc kí ái lực
(Affinity chromatography), kết tủa miễn dịch ( Immunopricipitate) , tạo liên kết chéo
( Cross-linking).
Phương pháp kết tủa miễn dịch dựa vào phản ứng kháng nguyên với kháng thể. ở
đây người ta dùng chất mang (Sepharose) gắn với protein A tương tác với kháng thể để
kết tủa phức hệ kháng nguyên kháng thể đồng thời kéo theo các protein khác tương tác
với protein nghiên cứu (kháng nguyên). Các protein kết tủa cùng sẽ được tách ra để
nghiên cứu (Harlow,E.,P.Whyte and S.J.Elledge.1993:Cell,75:805-816).
Mục đích của phương pháp tinh sạch ái lực miễn dịch:
- Xác định nồng độ của KT trong huyết thanh
- Kiểm tra sự có mặt của KN
2. Tính chất yêu cầu của kháng thể
Kháng thể phải tinh khiết.
3. Các bước tiến hành (3)
3.1. Gắn kháng thể lên giá (5)
3.1.1. Sử dụng phương pháp dùng chất hấp phụ đặc hiệu sinh học hay là phương pháp
sắc ký ái lực (affinity Chromatography).
Cơ sở của phương pháp này là người ta gắn những phân tử gắn (ligand) vào
chất mang (chất giá) rắn bằng liên kết cộng hóa trị mà protein enzyme cần tách sẽ tương
tác đặc hiệu với nó. Những chất đó có thể là cơ chất (Substrate) hoặc chất ức chế
(inhibitor) cạnh tranh. Trong trường hợp hai chất kháng nguyên và kháng thể có ái lực
liên kết đặc hiệu với nhau, người ta thay thế vị trí chất gắn vào giá thể giữa kháng nguyên
và kháng thể để nghiên cứu từng loại giống như cơ chất, chất ức chế và enzyme đặc hiệu
của chúng. Hay nói cách khác dùng chất chỉ có khả năng liên kết đặc hiệu với một
enzyme hoặc protein ta nghiên cứu. Chất mang thể rắn có thể là bất kỳ một loại nào phục
vụ cho lọc gel như sephadex, nhưng người ta hay sử dụng nhất là gel Sepharose.
* Nếu chất giá là sephadex thì chúng ta có chất trao đổi ion
sephadex. Đó là các loại DEAE - sephadex và CM - sephadex. Ưu điểm của loại này là
vừa tách được protein enzyme về kích thước và về điện tích tổng số của các protein
enzyme.
12
IMMUNOAFFINITY PURIFICATION
Trường hợp CM - sephadex trên chất giá sephadex có gắn nhóm COO-
Ở trên cột giá thể hay chất mang chứa cơ chất cố định ở pH và lực ion phù hợp,
chỉ có protein enzyme nào có khả năng chuyển hóa cơ chất mới gắn vào, các protein khác
thì chảy xuống cột. Bằng cách thay đổi pH và lực ion phù hợp hoặc có thể bằng cách
thêm chất ức chế cạnh tranh đã được hòa tan vào thì có thể tách được protein enzyme
khỏi cột ở trạng thái sạch.
3.1.2. Gắn kháng thể hoặc kháng nguyên lên giá bằng phương pháp Elisa (7)
ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) hay EIA (Enzyme
ImmunoAssay) là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong
mẫu xét nghiệm. Hiện nay ELISA được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu
như y học, nông nghiệp và đặc biệt là trong các quy trình kiểm tra an toàn chất lượng các
sản phẩm sinh học. Nguyên lý của ELISA chính là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên -
kháng thể và gồm các bước cơ bản như sau:
(1) Kháng nguyên - antigen chưa biết được gắn trên một bề mặt.
(2) Kháng thể - antibody biết trước được "rửa" qua bề mặt đó. Kháng thể này được
gắn kết với enzyme.
(3) Thêm vào một cơ chất (substance); enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín
hiệu có thể xác định được.
Đối với các ELISA phát quang, ánh sáng sẽ được phát ra từ mẫu chứa kháng thể -
kháng nguyên. Sự hiện diện của phức hợp kháng thể - kháng nguyên sẽ quyết định cường
độ sáng phát ra.
Với nguyên lý trên, ELISA giúp xác định sự có mặt hay không có mặt cũng như
lượng KN trong mẫu nghiên cứu.
Để tiến hành ELISA cần phải có ít nhất một kháng thể đặc hiệu cho kháng nguyên
chưa biết. Thông thường kháng nguyên được cố định tại các giếng của vi phiếm
(polystyrene microtiter plate).
- Phương thức cố đinh không đặc hiệu: KN gắn trực tiếp vào bề mặt của đĩa
- Phương thức gắn đặc hiệu ("sandwich" ELISA): kháng nguyên được gắn với một
kháng thể đặc hiệu cho cùng kháng nguyên cần kiểm tra
Kháng thể đặc hiệu sẽ được thêm vào, phản ứng tạo phức hợp kháng thể - kháng
nguyên có thể xảy ra.
Nếu kháng thể được gắn trực tiếp với enzyme, tín hiệu quang học do enzyme làm
biến đổi cơ chất sẽ giúp phát hiện kháng nguyên cần kiểm tra. Trong trường hợp sử dụng
kháng nguyên thứ cấp (secondary antibody) được gắn với enzyme thông qua các liên kết
cộng hóa trị giữa các phân tử sinh học (bioconjugation), kháng nguyên cần xác định sẽ
được nhận biết qua kháng thể thứ cấp này.
Giữa các bước của ELISA, các protein và các kháng thể không đặc hiệu, kháng thể
không gắn với KN sẽ được lấy đi nhờ các loại dịch có tác dụng "rửa". Sau bước "rửa"
13
IMMUNOAFFINITY PURIFICATION
cuối cùng, chỉ còn kháng thể liên kết với nguyên được giữ lại. Sau khi được thêm vào, cơ
chất sẽ chịu tác dụng của enzyme liên kết với kháng thể trong phức hợp kháng thể -
kháng nguyên. Phản ứng phát quang (biến đổi cơ chất) sẽ sảy ra.
Trước đây các cơ chất tạo màu sắc được sử dụng trong ELISA nhưng ngày nay
các chất phát quang được dùng rộng rãi làm tăng tính đặc hiệu và độ chính xác của
ELISA.
3.1.3. Một số cách thực hiện gắn kháng thể hoặc kháng nguyên lên giá (7)
3.1.3.1. ELISA gián tiếp (indirect ELISA) gồm các bước chính:
- Chuyển kháng nguyên đã biết lên bề mặt cứng ( được gọi chung là các đĩa).
Kháng nguyên sẽ được cố định trên bề mặt. Nồng độ của các mẫu kháng nguyên này
dùng để thiết lập đường chuẩn cho việc tính nồng độ của kháng nguyên trong các mẫu
chưa biết.
- Chuyển các mẫu kháng nguyên chưa biết vào các giếng khác. Kháng nguyên
chưa biết được hòa tan trong cùng một loại dung dịch đệm giống các mẫu KN chuẩn.
- Thêm dung dịch protein không tương tác (non-interacting protein) như albumin
huyết thanh bê (bovine serum albumin) hay casein vào tất cả các mẫu (kể cả mẫu chuẩn).
Bước này được gọi là "blockin" do protein huyết thanh có tác dụng ngăn cản sự hấp phụ
của các protein khác lên bề mặt của đĩa.
- Rửa bề mặt đĩa sau đó chuyển kháng thể (biết trước) vào tất cả các giếng của đĩa.
Kháng thể sẽ kết hợp với các kháng nguyên đã được cố định mà không kết hợp với
protein của huyết thanh.
- Thêm kháng thể thứ cấp (secondary antibody), kháng thể thứ cấp sẽ kết hợp với
bất kỳ một kháng thể còn dư (bước này có thể được bỏ qua nếu kháng thể dùng để phát
hiện KN đã gắn với enzyme).
- Rửa đĩa, các kháng nguyên gắn enzyme còn dư sẽ được loại bỏ.
- Thêm cơ chất. Enzyme sẽ làm biến đổi cơ chất làm sản sinh tín hiệu huỳnh
quang hay tín hiệu điện hóa học (enzyme có tác dụng như yếu tố khuyếch đại).
Nhược điểm cơ bản: Bước cố định kháng nguyên không có tính đặc hiệu nên bất
kỳ protein nào cũng gắn với bề mặt đĩa vì vậy kháng thể (có nồng độ thấp) phải cạnh
tranh với các protein khác trong huyết thanh khi gắn kết với bề mặt của đĩa. Sandwich
ELISA hạn chế được nhược điểm này.
3.1.3.2. Sandwich ELISA:
Phương pháp được sử dụng để phát hiện kháng nguyên trong mẫu nghiên cứu và
bao gồm các bước cơ bản sau (quy trình có thể được thay đổi trong nhiều trường hợp):
(1) Chuẩn bị bề mặt (microtiter) có gắn kháng thể
(2) Khóa tất cả những vị trí gắn kết không đặc hiệu trên bề mặt.
(3) Phủ mẫu chứa kháng kháng nguyên cần xác định
(4) Rửa đĩa, kháng KN không được gắn kết sẽ bị rửa trôi
(5) Thêm các kháng thể đặc hiệu cho KN cần chẩn đoán
14
Không có nhận xét nào:
Đăng nhận xét